速讯：IF:17.694哥伦比亚大学通过TMT蛋白组学识别乳腺癌不同亚型

2022年2月，英属哥伦比亚大学在Nature Communications发表的题为“Proteomic analysis of archival breast cancer clinical specimens identifies biological subtypes with distinct survival outcomes”（IF：17.694）的研究成果，通过TMT对石蜡包埋（FFPE）样本研究，根据蛋白组数据，识别了不同生存结局的亚型，为临床乳腺癌分类提供理论依据。

中文标题：乳腺癌临床标本的蛋白质组学分析可识别具有不同生存结果的生物学亚型

(资料图片)

研究对象：乳腺癌石蜡样本

发表期刊：Nature Communications

影响因子：17.694

发表时间：2022年2月16日

运用生物技术：TMT蛋白组学

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研究背景

根据基因表达，将乳腺癌分类，这显著推进了乳腺癌的诊断，并进一步完善了患者的预后和预后的预测。例如基于PAM50 RNA的基因标签，越来越多地被用作鉴定内在乳腺癌亚型和推荐临床使用的生物标志物的金标准。但是，DNA或RNA表达的变化并不总是转化为蛋白表达的变化。目前已经提出了基于蛋白质表达谱的新分类，能更可靠地揭示支撑乳腺癌异质性的功能表型差异。虽然早期的研究提供了高质量的分析数据来对乳腺癌进行分类，但分析的病例数量有限，并且缺乏临床结果关联，不足以表征乳腺癌在临床行为和治疗反应方面的真实生物学异质性。此外，大量的冷冻材料难获取来进行研究。因此，与标准福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床标本兼容的方法，具有相关的长期结果数据，将更容易转化为临床可操作测试的信息。

在这项工作中，作者利用高灵敏度质谱方法，捕获FFPE肿瘤样品中的生物学特征。报告了300个特征明确的FFPE乳腺癌标本的全蛋白组图谱，并将结果与详细的临床结果、IHC和PAM50 RNA的内在亚型联系起来。

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研究思路

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研究结果

1. FFPE乳腺癌组织样本的蛋白质组学分析和研究队列的特征

作者收集了来自2008-2013年（n=178）和1986-1992年（n=122）诊断的患者的原代组织样本，分别命名为08-13队列和86-92队列，并收集了38个正常的乳房样本作为对照。患者亚型分布如图1b。使用TMT技术对样本进行检测，两个队列因为前处理和固定程序的差异，存在明显的批次效应，所以单独进行分析，样本聚类分析显示，38个SuperMix重复具有最高的相关性。

图1 FFPE乳腺癌组织样本的蛋白质组学分析

2. 蛋白质组分析揭示具有不同免疫反应和临床结果的不同乳腺癌亚型

研究者检查了08-13队列中蛋白质组学数据和PAM50分类之间的重叠，结果发现基底样亚型能被分离，但管腔A、管腔B和富含Her2的亚型聚集在一起（图2 a）。为了识别不同的基于蛋白质分类的亚型，使用一致性聚类算法对25%最易变的蛋白质进行了无监督聚类（n=1054）。检查共识矩阵、增量图以及共识累积分布函数（CDF）区域的变化，确定了四个明显的分组，包括了基于RNA的PAM50亚型（图2 b和c）。第一类主要由管腔B和Her2富集的PAM50病例组成；第二类主要是基础样亚型，包括很少的Her2，但没有腔内病例；聚类三也主要是基底样病例，但包括较多的Her2的病例；最后一类主要是富含Her2病例，但也包括一部分管腔A和管腔B病例。基底样型基本被分为簇2或3，其中聚类3显示出最好的无复发生存期（RFS）和总生存期（OS），而聚类2是最差（图3 a和b）。

图2 蛋白质组无监督共识聚类揭示了不同的乳腺癌亚型

通过计算，使用最显著区分簇3与其他簇的差异蛋白质来表征簇3。簇3显示出参与免疫反应相关途径的高丰度蛋白，包括与抗原加工和MHC I类呈递相关的转运蛋白和免疫蛋白酶体亚基等。基因集富集分析（GSEA）显示，簇3在免疫反应过程中显著富集；簇1具有脂肪酸代谢、分解代谢和氧化还原相关过程的上调；第2簇的临床结局最差（图3 a和b），富含基质和细胞外基质（ECM），包括胶原蛋白组织，血液凝固和血管生成过程，还富集到升高的DNA复制和修复功能，以及免疫反应相关途径的低表达；簇4富含基质和ECM成分、血液凝固、体液免疫反应和激素受体结合，但DNA损伤修复蛋白丰度低（图3 d）。

图3 08-13 队列中不同蛋白质组学乳腺癌集群的关键特征

3.关键亚型特异性乳腺癌蛋白的表达与每个蛋白质组簇的生物学特征一致

检查了乳腺癌生物标志物的蛋白质组学丰度，在簇2中观察到基底细胞角蛋白（KRT17，KRT14，KRT2）的上调，增殖标志物MKI67在簇2中较高，而在簇4中较低(图3 e)，Her2的生物标志物（ERBB2，GRB7）在簇1中显著高表达（图3 e）。PRKDC是CPTAC14报告的对基底样亚型最特异的生物标志物，在簇2中表达明显更高。

4. 不同蛋白质组乳腺癌亚型的临床病理特征

第2和第3簇中的大多数病例的临床数据显示与ER、PR和Her5阴性、高增殖指数（Ki67）和核心基底表型（定义为ER-、PR-、Her2-和[EGFR+或CK5+]）相关。与第2和3簇相比，1和4簇病例大多接受化疗，没有增加激素治疗。与其他簇相比，簇2具有更高的复发率，并且与脑和肺转移有关，这是侵袭性基底样亚群临床行为的特征，而簇4与骨转移有关。

5. 关键免疫生物标志物的形态学表达表征蛋白质组免疫热簇

因为免疫热簇3具有最有利的结果，作者检查了它是否含有高水平的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）。与其他簇相比，免疫热簇的连续和分类TIL评分显著更高（图2 c和4 a）。此外，在肿瘤内区室中的CD8 TIL也显著更高（图4 a）。评估了ECM区室在整个宏观解剖肿瘤区域中的百分比，第4簇的ECM百分比最高，基质富集度更高（图4a）。

作者通过IHC评估了免疫热簇的蛋白质特征。选择四种（TAP1、HLA-DQA1、IFIT2和S100A8）进行检测，这些蛋白在正常乳房组织中没有高表达。相比于其它簇，这些蛋白在免疫热簇中显著更高，在簇2中表达最低（图4 c）。

图4 关键免疫生物标志物的表达表征了08-13队列中蛋白质组免疫热簇的特征

6. 抗原呈递蛋白TAP1和HLA-DQA1联合IHC表达与生存相关

随后作者评估了这四个蛋白的预后价值，发现高表达TAP1或HLA-DQA1作为单一生物标志物的肿瘤显示出更好的无复发生存期（RFS）。然后检查了它们组合IHC值的预后价值，TAP1和HLA-DQA1高IHC表达的肿瘤表现出好的RFS，而两者低表达的亚组的RFS最差。然后在独立的队列中进行验证，发现HLA-DQA1高表达有着更好的生存率。

7. 与以往的乳腺癌蛋白质组学研究比较

为了验证已发表的数据集的结论，作者使用两个以前的蛋白质组学数据集（CPTAC乳腺癌队列，OSLO2乳腺癌队列）的数据进行验证。使用08-13队列和CPTAC乳腺肿瘤蛋白质组进行聚类，确定了四个主要的蛋白质组簇。分析研究表明在蛋白质组水平上存在富集免疫反应途径的亚群，这些亚群包括基底样和富含Her2的亚型。使用08-13队列和OSLO2队列进行聚类分析，这些共同的蛋白与Johansson等人报道的四个主要核心肿瘤簇（CoTC）及其生物学功能高度相似。重要的是，使用文中的高度变异的蛋白质完全再现了基底样亚型的免疫差异。

8. 三阴性乳腺癌包括四个临床不同的蛋白质组簇

为了研究蛋白质组学数据能否以更具临床信息性的方式对TNBC（三阴性乳腺癌）病例进行细分，分析了88例IHC定义的TNBC病例。使用共识聚类算法对25%变化最大的蛋白质（n=1055）进行无监督分类，确定了四个稳定簇（图5 a和b），在RFS和OS方面具有明显的预后差异（图5 c）。TNBC-簇-1主要由基底样病例组成，与其他集群相比具有最好的生存率（图5 c），该簇患者TIL含量高，TAP1和HLA-DQA1表达高（图5 a）。TNBC-簇-2主要是基底样病例，生存率中等，在ECM、凝血和体液免疫反应过程中富集。TNBC-簇-3主要是PAM50富集her2的病例，生存期中等，并在脂质代谢、分解代谢和氧化还原过程中富集。TNBC-簇-4都是基底样病例，表现出最低的生存率，富含DNA复制和细胞周期蛋白，具有很少的免疫相关肽（图5 c和d）。

图5 蛋白质组学分析显示08-13队列中TNBC的四种临床重要亚型

9. 鉴定与TNBC临床结果相关的蛋白质生物标志物

作者确定了TNBC的候选预后生物标志物，使用Cox比例风险分析对蛋白质丰度和生存结果进行分析，确定了85种与较长RFS显著相关的蛋白质，包括几种免疫相关蛋白质，以及18种与不良RFS显著相关的蛋白（图6）。与良好RFS相关的85种蛋白质中，44种在TNBC-Cluster-1中显著高表达。

图6 火山图显示与TNBC中RFS显著相关的蛋白质

10. 蛋白质组学特征捕获管腔乳腺癌的生物学异质性

86-92队列中的病例由IHC确认分类为ER+的患者，共识聚类确定了3个主要簇：86–92-聚类-1、86–92-聚类-2和86–92-聚类-3（图7 a）。86–92-聚类-1和聚类-2以腔内A型为主，86–92-聚类-3以腔内B型为主（图7 a）。86–92-聚类-1具有升高的RNA加工和剪接过程，但参与抗原加工和呈递以及I型和II型IFN信号传导的免疫相关蛋白耗尽；86–92-聚类-2富含基质蛋白和ECM成分，包括几个胶原蛋白成员；86–92-聚类-3在DNA复制、细胞周期、对DNA损伤的反应和免疫反应方面具有高表达的蛋白（图7 b）。

图7 蛋白质组学特征捕捉了86-92队列中管腔乳腺癌的生物学异质性

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研究结论

本研究对来自2008-2013年（n=178）和1986-1992年（n=122）诊断的患者，共300个FFPE乳腺癌手术标本进行了全面的蛋白质组学分析，量化了所有样本中的4214个蛋白。在侵袭性PAM50分类的基础样病例中，蛋白质组学分析显示分为两组，其中一组具有特征性的免疫热表达特征和高度有利的生存率。富含Her2的病例根据细胞外基质、脂质代谢和免疫反应特征分为不同的异质组。在88例三阴性乳腺癌中，四个蛋白质组学簇显示出基础免疫热、基底免疫冷、间充质和管腔的特征，且具有不同的生存结果。本文的蛋白质组学分析以临床适用的方式来表征乳腺癌的异质性，确定潜在的生物标志物和治疗靶点，并为临床乳腺癌分类提供资源。

本文使用现有的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织标本进行深入蛋白组学研究和分析，为开发乳腺癌的诊断和预后生物标志物提供了宝贵的资源。由鹿明生物开发的超微量蛋白质组学鉴定方法，实现了对切片类样本稳定且高效的鉴定。对样本新鲜程度的大大降低，能够对一定时间区域内的样本进行回顾性信息的深度挖掘。

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